茶葉中真菌毒素的污染及快速定量檢測(cè)方案--8min準(zhǔn)確定量

一、真菌毒素概述

真菌毒素是某些真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的，危害人和動(dòng)物的次級(jí)毒性代謝產(chǎn)物 。迄今發(fā)現(xiàn)超過(guò)400種真菌毒素，主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、單端孢霉烯族毒素 中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和Ｔ-２ 玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、雜色曲霉素、桔青霉素等。真菌毒素主要由曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬中產(chǎn)生。這些微生物廣泛分布在植物、土壤和空氣當(dāng)中，可能污染谷物、大豆、堅(jiān)果、水果、調(diào)味料、可可、咖啡、中草藥等植物性食物及其制品（如葡萄、啤酒）、飼料等。并可能在原料、加工、儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)污染食物或飼料，從而進(jìn)入食物鏈 。世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)顯示，每年全世界有25％的谷物受到真菌毒素污染，由此，美國(guó)年均損失約93.2億美元 。另外谷類(lèi)和堅(jiān)果中的真菌毒素可能是非洲、亞洲和南美洲消費(fèi)者面臨的食品中最主要的不安全因素 。

二、茶葉中存在哪些真菌毒素

 近年來(lái)關(guān)于茶葉尤其普洱茶等經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵茶葉的真菌毒素污染已引起消費(fèi)者的關(guān)注。茶葉是指茶樹(shù)的干燥嫩葉與嫩莖，已成為世界上除了水之外消費(fèi)最多的飲料，其安全性對(duì)消費(fèi)者的健康以及茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤其重要。產(chǎn)毒真菌分布廣泛，茶園土壤和加工車(chē)間等都有可能存在，茶葉加工可能受到產(chǎn)毒真菌污染。雖然干燥環(huán)節(jié)可能殺滅紅茶、綠茶中的大多數(shù)微生物，但干燥之后如果包裝、貯藏不當(dāng)，尤其茶葉吸濕受潮之后，可能受到真菌和真菌毒素污染。而普洱茶、茯磚茶等黑茶后發(fā)酵過(guò)程及產(chǎn)品中本身存在曲霉屬、青霉屬等多種真菌菌種， 也可能受真菌毒素污染 。但目前僅見(jiàn)印度對(duì)紅茶的黃曲霉素做了限量規(guī)定（30ug/kg）。GB2761—2017未規(guī)定茶葉制品真菌毒素限量。

            2.1. 紅茶真菌毒素相關(guān)研究

紅茶是指茶樹(shù)鮮葉經(jīng)過(guò)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等步驟生產(chǎn)出來(lái)的茶葉產(chǎn)品，是世界上產(chǎn)量最大的茶葉類(lèi)別，也是除中國(guó)、日本外其他國(guó)家的主要消費(fèi)品種，因此目前關(guān)于紅茶污染真菌毒素的研究報(bào)道相對(duì)較多。

早在1974年，日本學(xué)者Hitokoto等就開(kāi)展了東京市售茶葉毒素產(chǎn)生菌污染的研究，從東京市售的19份紅茶樣品中，分離得到259 株泡盛曲霉，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些真菌可在酵母蔗糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生雜色曲霉素，表明紅茶受到了毒素產(chǎn)生菌的污染。Abdel-Hafez等應(yīng)用薄層層析測(cè)定發(fā)現(xiàn)，4份紅茶粉樣品受到黃曲霉毒素B1和B2污染，含量為2.8~2.17 mg/kg。Hasan 等從埃及市售的20個(gè)品牌紅茶粉中分離得到多株黃曲霉，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中15 株可產(chǎn)黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2，5株可產(chǎn)生黃曲霉毒素B1和B2；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，茶葉接種產(chǎn)毒菌株后，可產(chǎn)生黃曲霉素，且毒素含量隨含水量增大而增加；茶葉含水量45％，28℃，培養(yǎng)20d的條件下毒素含量最大，可達(dá)26～ 81ug/kg。Elshafie 等從購(gòu)于馬斯喀特的４ 個(gè)品牌48份紅茶樣品中，分離鑒定出５種真菌，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分離的25株黃曲霉均不產(chǎn)生黃曲霉毒素。Ostry等在紅茶中檢測(cè)到了可能產(chǎn)生黃曲霉素的黃曲霉菌株。Martins等測(cè)定發(fā)現(xiàn)，購(gòu)于里斯本的18份紅茶樣品中，有16份樣品污染了伏馬菌素Ｂ1，含量為80~280ｍｇ/ｋｇ，未檢測(cè)到伏馬菌素Ｂ2。Miraglia報(bào)道，1995-1998年歐盟國(guó)家檢測(cè)了139份紅茶樣品，其中8份樣品中赭曲霉毒素A陽(yáng)性， 含量為0.03~10.3 μｇ/ｋｇ。Hasan發(fā)現(xiàn)接種黃曲霉菌株之后，脫咖啡因紅茶中的黃曲霉毒素是普通茶葉的5倍。Ｒ?ｅｚáｃ等分析發(fā)現(xiàn)，布拉格市售的10個(gè)紅茶樣品受到真菌污染，但符合捷克的標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)毒試驗(yàn)表明分離的真菌不產(chǎn)黃曲霉毒素。Santos 等應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了西班牙市售的包括紅茶在內(nèi)的84個(gè)藥用或芳香植物中的黃曲霉毒素、赭曲霉毒素Ａ、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、Ｔ-2毒素、桔青霉素和伏馬菌素，發(fā)現(xiàn)樣品普遍受到毒素污染。Mogensen 等發(fā)現(xiàn)從紅茶中分離到的Aspergillusacidus不產(chǎn)生赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素Ｂ2 和Ｂ4。Monbaliu等建立了一個(gè)可同時(shí)測(cè)定27 種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測(cè)了91份茶葉樣品，結(jié)果只有1 份樣品檢測(cè)到伏馬菌素B1（76ug/kg）。

 研究發(fā)現(xiàn)紅茶中真菌數(shù)量及毒素含量與含水量有關(guān)，茶葉受潮后真菌會(huì)大量繁殖、產(chǎn)生毒素。真菌孢子在加工的很多環(huán)節(jié)都可能污染紅茶、綠茶等茶葉產(chǎn)品，但真菌生長(zhǎng)及產(chǎn)生毒素需要一定的水分，如果茶葉干燥徹底、貯藏過(guò)程不受潮，即使茶葉含有真菌孢子，但不會(huì)繁殖，也不會(huì)產(chǎn)生真菌毒素。因此，對(duì)于紅茶、綠茶等茶葉加工企業(yè)來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)徹底干燥、及時(shí)包裝或真空包裝、儲(chǔ)存運(yùn)輸過(guò)程不受潮，來(lái)降低或杜絕真菌毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于茶葉消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，打開(kāi)包裝之后應(yīng)檢查茶葉是否霉變、開(kāi)封后的茶葉必須干燥存放、勿飲用霉變茶葉，避免受到真菌毒素危害。

               2.2. 黑茶真菌毒素研究

  黑茶指制造工序?yàn)轷r葉經(jīng)殺青、揉捻、渥堆（后發(fā)酵）、干燥，成品茶呈油黑或黑褐的茶種。主要有云南普洱茶、湖南茯磚茶、四川康磚茶、廣西六堡茶等。由于獨(dú)特品質(zhì)及良好的保健功效，近年來(lái)黑茶產(chǎn)量及消費(fèi)量都逐漸增大。但普洱茶等黑茶加工有一個(gè)多種微生物作用的后發(fā)酵過(guò)程，這些微生物可能產(chǎn)生毒素。如普遍認(rèn)為的普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌黑曲霉是一般公認(rèn)安全的微生物，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)黑曲霉的某些菌株可能產(chǎn)生赭曲霉毒素和伏馬毒素；茯磚茶的優(yōu)勢(shì)菌散囊菌屬的一些菌種也可產(chǎn)生赭曲霉毒素和伏馬毒素等真菌毒素。目前有關(guān)黑茶真菌毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，部分學(xué)者開(kāi)展了相關(guān)研究。

Hitokoto 等分析了共１１ 份茶葉樣品，其中２ 份為普洱茶樣品，發(fā)現(xiàn)普洱茶真菌數(shù)量最多，優(yōu)勢(shì)菌是雜色曲霉和聚多曲霉；其中１ 株雜色曲霉在小麥培養(yǎng)基上產(chǎn)生了雜色曲霉素，但在綠茶中未產(chǎn)生毒素；聚多曲霉在葡萄糖酵母和小麥培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生毒素。陳秋娥分析了44 件臺(tái)灣市售普洱茶樣品，未檢測(cè)到黃曲霉毒素、赭曲霉毒素Ａ、雜色曲霉素和桔青霉素；同時(shí)陳秋娥還研究了黃曲霉在普洱茶發(fā)酵中的產(chǎn)毒素情況，發(fā)現(xiàn)不接種黃曲霉菌株的普通發(fā)酵（對(duì)照組）和不滅菌茶葉接種黃曲霉菌株的發(fā)酵樣品均未檢出黃曲霉毒素；滅菌茶葉接種黃曲霉菌株的樣品檢出黃曲霉毒素（1.05 ug／kg），該研究表明正常的普洱茶發(fā)酵過(guò)程不會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素。Abe等應(yīng)用HPLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從普洱茶中分離的黑曲霉不產(chǎn)生赭曲霉毒素A和伏馬菌素。Mogensen等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從普洱茶樣品中分離的Aspergillusacidus不產(chǎn)生赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素Ｂ2和Ｂ4。ＨＯＵ 等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用黑曲霉和炭黑曲霉（Ａ.Carbonarius）發(fā)酵的茶葉樣品不含赭曲霉毒素A和伏馬菌素。陳建玲等隨機(jī)抽查廣州某茶葉市場(chǎng)濕倉(cāng)儲(chǔ)存的普洱茶７０ 份樣品，發(fā)現(xiàn)其中８ 份樣品（11.43％） 黃曲霉毒素Ｂ1>5μｇ/ｋｇ，63份樣品（90％）脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染＞ １ ｍｇ/ｋｇ，伏馬毒素（Ｂ1 和Ｂ1）和Ｔ-２ 毒素毒素含量雖然都分別小于１mg/kg 和100μｇ/ｋｇ，但在樣品中均可檢出，應(yīng)引起廣泛重視。ZHANG等應(yīng)用免疫層析法檢測(cè)，并用高效液相色譜?質(zhì)譜法（HPLC-MS）驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)５ 份普洱茶樣品都含有黃曲霉毒素，含量為４.９ ～５９.３ μｇ/ｋｇ。柳其芳應(yīng)用酶聯(lián)免疫測(cè)試盒測(cè)定，發(fā)現(xiàn)普洱茶黃曲霉毒素污染水平超過(guò)２０ μｇ/ｋｇ 的有１０ 份（16.6％），脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染水平超過(guò)1000μｇ／ ｋｇ 的有13份（23.0％）；玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、赭曲霉毒素、Ｔ-２ 毒素在樣品中均可檢出。Haas等檢測(cè)了３６ 份普洱茶樣品，未檢測(cè)到黃曲霉素（Ｂ1，Ｂ2，Ｇ1和Ｇ2）和伏馬菌素（Ｂ１，Ｂ２ 和Ｂ３），４ 份樣品檢測(cè)到赭曲霉毒素Ａ，含量為0.６５ ～ ９４.７ μｇ/ｋｇ。趙浩軍等應(yīng)用ＨＰＬＣ 方法檢測(cè)了市售普洱茶２ 份樣品，均未檢出黃曲霉毒素Ｂ1。

   陳秋娥接種黃曲霉菌株發(fā)酵普洱茶的研究表明，正常的普洱茶發(fā)酵過(guò)程不會(huì)產(chǎn)生黃曲霉素，Ａbe等、Ｍogensen 等和ＨOU等３ 個(gè)獨(dú)立研究都表明，普洱茶發(fā)酵過(guò)程的曲霉菌種不產(chǎn)生赭曲霉毒素Ａ 和伏馬菌素。以上研究均表明，正常的普洱茶發(fā)酵不會(huì)產(chǎn)生真菌毒素。由于樣品及測(cè)定方法不同，關(guān)于普洱茶產(chǎn)品中真菌毒素檢測(cè)的報(bào)道不一致。陳建玲等、ＺＨＡＮＧ 等和柳其芳檢測(cè)的普洱茶樣品較大程度受到黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素和Ｔ-２ 毒素污染；而陳秋娥 和趙浩軍等分別檢測(cè)了44和2份市售普洱茶樣品，未檢出毒素。Ｈaas 等分析了36 份樣品的８ 種真菌毒素，僅4份樣品檢測(cè)到赭曲霉毒素Ａ。

   近年來(lái)有關(guān)黑茶的真菌毒素污染引起了廣泛關(guān)注，應(yīng)加強(qiáng)過(guò)程控制，檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程真菌是否產(chǎn)生毒素；篩選、應(yīng)用不產(chǎn)毒素菌株發(fā)酵并監(jiān)測(cè)是否產(chǎn)毒，建立安全的黑茶發(fā)酵技術(shù)體系。

               2.3. 其他茶葉真菌毒素研究

 有關(guān)綠茶、白茶中真菌毒素的研究不多，僅Ｒｅｅｚáｃˇｏｖá 等分離１０ 份捷克市售綠茶樣品中的真菌，發(fā)現(xiàn)均不產(chǎn)生黃曲霉毒素。Ｓantos等檢測(cè)了西班牙市售的綠茶和白茶樣品，發(fā)現(xiàn)部分檢測(cè)樣品受到黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、Ｔ-２ 毒素和桔青霉素污染。趙浩軍等檢測(cè)了2份綠茶樣品，未檢出黃曲霉毒素Ｂ1。

綜上，無(wú)論黑茶、紅茶、綠茶都可能受到真菌毒素的污染。飲用真菌毒素污染的茶葉對(duì)健康不利，但另一方面，也有大量文獻(xiàn)研究表明，綠茶、紅茶、普洱茶等都具有“解毒”作用，可以降低黃曲霉毒素等真菌毒素的毒性。因此今后應(yīng)開(kāi)展茶葉真菌毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，準(zhǔn)確評(píng)估茶葉中真菌毒素對(duì)人體健康的風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)茶葉加工工藝與制品類(lèi)別眾多，生產(chǎn)廠(chǎng)家也很多，且多數(shù)規(guī)模不大，因此更應(yīng)重視茶葉可能受到毒素污染的情況。建議開(kāi)展不同品種茶葉制品真菌毒素檢測(cè)研究，普查各類(lèi)茶葉制品受到真菌毒素污染情況，并根據(jù)真菌毒素污染情況，制定茶葉毒素的限量指標(biāo)。對(duì)于有微生物參與發(fā)酵的茶類(lèi)（如黑茶），通過(guò)應(yīng)用不產(chǎn)毒素菌株發(fā)酵、監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程毒素等措施建立安全的發(fā)酵技術(shù)。我國(guó)茶葉企業(yè)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)茶葉毒素的過(guò)程控制及監(jiān)測(cè)，降低茶葉受到真菌毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)，以保障飲用安全。

三、上海飛測(cè)生物茶葉中真菌毒素快速定量檢測(cè)方案--8min準(zhǔn)確定量

上海飛測(cè)生物基于領(lǐng)先的熒光定量FPOCT技術(shù)平臺(tái)，率先推出了常見(jiàn)的六種真菌毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)系統(tǒng)，包含真菌毒素檢測(cè)儀和真菌毒素熒光定量快速檢測(cè)試紙條，可在8min快速準(zhǔn)確定量的檢測(cè)出茶葉中真菌毒素的殘留含量，樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠且可現(xiàn)場(chǎng)打印，準(zhǔn)確性符合HPLC法的檢測(cè)結(jié)果，適用于各類(lèi)茶葉加工企業(yè)、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)及政府監(jiān)管部門(mén)。

 

3.1. 上海飛測(cè)生物真菌毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條性能

3.2. 以檢測(cè)茶葉中的黃曲霉毒素B1為例：

黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測(cè)系統(tǒng)性能

 檢測(cè)靈敏度：0.5μg/kg；

 定量線(xiàn)性范圍：1.0μg/kg - 75.0μg/kg；

 樣品前處理時(shí)間：7min；

 檢測(cè)時(shí)間：8min；

 準(zhǔn)確度：回收率為80%-125%；

 特異性：在1000μg/kg濃度水平下與其它真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)；

3.3. 樣品前處理過(guò)程

1、 粉碎（茶葉樣品粉碎處理）；

2、 振蕩提取（5min）；

3、 離心（2min）；

 

 

3.4. 檢測(cè)操作過(guò)程

1、 稀釋?zhuān)?/span>

2、 加樣反應(yīng)（8min）；

3、 讀數(shù)，打印檢測(cè)報(bào)告； 

 

3.5. 結(jié)果判讀和輸出

    采用便攜式黃曲霉毒素檢測(cè)儀進(jìn)行讀數(shù)，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、客觀，避免人為的誤判。

    檢測(cè)結(jié)果將呈現(xiàn)于熒光讀數(shù)儀液晶顯示屏上，同時(shí)可按打印鍵打印獲得紙質(zhì)的檢測(cè)報(bào)告，另外，開(kāi)通儀器的WIFI數(shù)據(jù)上傳功能后，檢測(cè)相關(guān)數(shù)據(jù)信息將自動(dòng)上傳至“食品安全溯源管理云平臺(tái)”，便于溯源及質(zhì)量管理。

 

3.6. 上海飛測(cè)生物真菌毒素系列熒光定量檢測(cè)試紙條產(chǎn)品亮點(diǎn)

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