原理簡介
一、稀土元素發(fā)光特點(diǎn)
1、Stokes位移大
Stokes位移達(dá)200nm,很容易分辨激發(fā)光和發(fā)射光,從而排除激發(fā)光干擾。而普通熒光物質(zhì)熒光光譜的Stokes位移只有幾十納米,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜通常有部分重疊,互相干擾嚴(yán)重;
2、衰變時(shí)間長
鑭系元素與普通的熒光團(tuán)比較,鑭系元素離子螯合物熒光的衰變時(shí)間(decay time)長(10~2000us),為傳統(tǒng)熒光的103~106倍。通過時(shí)間分辨,可極大地降低了本底熒光,實(shí)現(xiàn)了高信噪比;
3、激發(fā)光譜寬而發(fā)射光譜窄
鑭系螯合物激發(fā)光光譜較寬,最大激發(fā)波長在300~500nm,可通過增加激發(fā)光能量來提高靈敏度。而發(fā)射光譜帶很窄,甚至不到10nm,可采用只允許發(fā)射熒光通過的濾光片,進(jìn)一步降低本底熒光,狹窄的發(fā)射波段為多次分析成為可能。
二、熒光納米微球
與經(jīng)典的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法DELFIA法不同,時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)采用熒光納米微球作為標(biāo)記物,每個(gè)微球中可包裹成千上萬個(gè)熒光分子,大大提高了標(biāo)記效率,有效的提高了靈敏度;同時(shí)納米熒光微球表面修飾有合適密度的羧基,用于與蛋白或抗體的共價(jià)偶聯(lián),提高標(biāo)記物的穩(wěn)定性。
三、時(shí)間分辨熒光免疫層析(TRFILF)原理
當(dāng)將含有待測抗原(抗體)的樣品滴在加樣區(qū),待測樣品中的抗原(抗體)與結(jié)合墊中的熒光納米微球標(biāo)記的抗體(抗原)結(jié)合并通過毛細(xì)作用向前層析,當(dāng)達(dá)到檢測區(qū)后,與檢測線上固定的抗體(抗原)結(jié)合,形成微粒-抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物并被固定在檢測線上,而多余的熒光微球標(biāo)記物繼續(xù)向前層析,與固定在質(zhì)控線二抗結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后,用紫外光源(340nm)對檢測區(qū)掃描檢測,檢測線和質(zhì)控線上熒光納米微球發(fā)出高強(qiáng)度的熒光(615nm),且衰變時(shí)間也較長。利用延緩測量時(shí)間,待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光(1-10ns)全部衰變后,再測量稀土元素的特異性熒光,這樣就可以完全排除特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱及其比值,即可分析出樣品中待測物的濃度。